微生物平板计数法的数据求真研究

(西北农林科技大学资源环境学院，712100)

摘要：微生物的平板计数法的数据求真属于复杂系统的信息求真问题，本文借此具体项目来研究复杂系统的信息求真问题，但写下来的主线是微生物的平板计数法数据求真。经过如此地一番折腾，明确了平板计数法的每一个细节，然后把它改造的结果是大大地简化了工作程度。

研究方法不同于《统计学》，也为改写统计学提供了依据和方向。

关键词：微生物平板计数法，复杂系统理论，数据求真，统计学，大数据。

前 言

比较集中地做土壤微生物的菌群分析已有四、五年了，每遇到问题想一下，时间久了竟集腋成裘而可以于此写一篇文字了。

看似简单的平板计数工作其实是一个复杂系统数据求真的问题，这自然要扩展到信息求真方面去，因此这一工作涉及到三个方面的知识，至于逻辑学是因为前两项存在问题而需要附加的：

⑴、统计学，高等数学。

⑵、复杂系统理论，数据挖掘，大数据，机器学习。

⑶、微生物学，微生物分类，微生物生态，土壤学，土壤生态学。

⑷、逻辑学。

高等数学是统计学的工具，统计学的主要工作是数据求真及数据处理方法。⑵中的复杂系统理论是主线，其它几项是它山之石可以攻玉。⑶中各项有助于了解原象的各种细节，在更大的范围内寻找解决问题的方法会更容易而更有效率。

一个具体的工作总是涉及到很多的领域，各个分项之间也总是有联系。本文的写作竟然用了近一年的时间，主要是等待推测的牛肉平板酸化的现象。其中需要用心的地方有两个方面：统计学和土壤微生态学。在这两个方面的基础的研究工作还差得很多，在一些已习以为常的地方其实错了。韩兆洲《统计学原理》这一本书有哪一部分是正确的？统计的调查是验证，调查则只以一部分或局部来了解整体。洛伦茨曲线中的实际收入分配曲线与实际的收入分布是不相符的，应有几个弯的，各弯部的弯度及其上方的数量会是有意义的。计划完成数能简单表达就不要搞成需要翻译或解说的表达形式。平均数有两种用法，一是求真，二是分类。平均求真用于相同的类，各数等价；平均分类是分不同的类，平均差是分类半径。证券网上的行业利率错用了平均数，须选代表数。问卷调查是辅助方法，调查结不可以进入研究阶段，现在被胡乱地应用算是《统计学》的功劳了。书中太多的假数据。统计指数让同济大学的《高等数学》出了丑，2015年7月9日的大盘指数有几个人看懂了？相关性使大数据产生了尿不湿与啤酒的假案例，其实，相关度的思考只是需要进一步细致化。学问的边界是要有实际的意义，统计学与数学在这方面是不同的，在实际中能简单处理的就不需要复杂化。《统计学原理》算了多不可能存在的题。虽然数学为我们提供了算法，但现实的数据来源才是求取合适算法的根本。

土壤微生态在时空之变方面的研究还差得很多，甚至是就没有这个思维。在朦胧之初，先有一个感觉——逻辑学是要再学习一下的，立地的辩证是不能违背逻辑的，也是统计学创。就统计学与复杂系统理论是花不了一年时间的，但认识与事实互训互进是再需要一年时间的。能够将平板计数法简化到不能再简的地步是因为对事实与理论有了更加清楚的认识——整体工作量减少了三分之二，计数工作量减少了九分之八。那么为什么不能再多一些时间了解事实呢？是因为了解的事实已能很好地支持需要解决的问题了，对事实可能的发展分枝的了解已尽。工作量减少后所得结果能正确呢？正是工作量减少后所得结果才是正确的，多余的工作反而不能求得正确的结果。

一个精致的东西是每一个细节都很精致，本文的工作也是仅仅如此而已，没有什么妙招。如此地一番折磨，在统计学、复杂系统理论、土壤微生态学方面有所得之后才能完成本文的工作。统计学概是需要改写了，一些思考会在本文中有所反映。高等数学领域的工作应先把基础的方面搞扎实，应确保其正确无误。经济学中的边际分析的乱用与超边际分析是学术的大笑话，指数的应用范围须是受到编制方法限制的。数据挖掘的问题与统计学相同，方法编制者缺乏对实在的数据的研究经验，太多的假案例、假数据了，把本来很简单的问题搞得很玄乎，应用者竟多盲目跟随。大数据的问题是要解决信息的代表性问题，即信息映射是否正确的问题，其方法不外乎就是要对实际情况多了解。机器学习应用了数据挖掘的方法，这迟滞了机器学习的发展。或许是，机器学习走了和人的思维不同的路——不需要正确的基点和逻辑？不需要简化思维？

欧阳莹之（Sunny Y.Auyang）的《复杂系统理论》在《经济学》领域写了过多的她并不了解的内容，看似很花梢的各种模型所阐述的内容却是错误的，是自己糊涂还是认为他人是弱智？GDP是国民生产总值吗？在中学数学中有一个关于成本利率的计算题，但是，产品价格的利率才是有意义的，各行业的产品有比较固定的利润率。价格即成本，其实，书中的成本所对应的利息不应是该商品的利润，只是其中的一部分。有的《复杂系统理论》涉及到了量子理论与宇宙理论方面，作者懂这两个领域吗？这两个领域的研究者们真懂了吗？就堆积材料的研究方法来看应该还没有真懂。没有摆脱《宇宙大爆炸理论》的《黑洞理论》是这种研究的代表，霍金的《时间简史》也同样经不起辩证。复杂系统有坐标的问题，其中重要的是边界与节点的问题，不能指望只从一个坐标看清所有的问题，超过四维的任何一维能将系统撕碎，测量重力场的长杆应该长过银河系。将系统理论乱用到复杂系统的不少，系统理论败于控制论的乱用，缺少对个体作用的考虑。自组织理论不能推到复杂系统，乱用其它领域的知识到社会科学领域的还比较多。复杂系统发展到目前不是一无是处，但也只是一些积累。复杂系统中的单一信息可能会存在噪音的问题，这需要寻求信息映射确定的途径。

平板计数法的中国国标有权威性，但其改变经验有效计数范围的做法却是错误的，错在缺乏对实际情况的掌握以及对数据的敏感性。

重要的是多了解实际情况而不是假设，虚假案例的数据是没有智慧可究的，因为，思维的起点以正确的基点为可靠。虽然也存在前提错误还会有正确结论的逻辑，但其副产物会于思维有害而使思想不能走得更远。

案例涉及到什么就需要了解什么，他人的学问是否靠得住是需要自己能够证明的，一不小心就容易中计，做学问并不容易。

研究工作就是这样的，不只是搞清楚了平板计数法的工作细节，其它所得或许更重要。其实呢，研究复杂系统理论才是我真正关心的问题。至于统计学方面的问题，那只是捎带的。

原则是必须坚持的必要条件，规则是方法或者是规范的要求等，规则与方法的区别是除了遵守规则外不能另有所求。有了原则便容易找到规则、方法、途径等，而原则也是要在寻找方法的过程中得到。本文中的三个原则及一个规则便是如此来的，学问出于头脑的思维。追根究底的话还需要扯到思维方式方面去，但在这里必须打住了。

为什么会忍受花一年的时间来写这篇文字呢？因为，此后在某些方面会快如闪电。在这种看似简单的问题上往往是我们错得不经意之处，也是许多问题长期存在的根源。当然，对于统计学的不堪是事先就知道一些的，只是以前不能否定得如这次这般的彻底。

1.平板计数法的计数工作并不简单

1.1微生物菌群分析的平板计数法

为了揭示了土壤微生物群落的多样性和生态功能的多样性，土壤微生物研究方法经历了微生物纯培养、土壤酶活性（BIOLOG微平板分析）、微生物库（如微生物生物量）和流（C和N循环）、微生物生物标记物（FAMEs）、微生物分子生物学技术（从土壤中提取DNA，进行PCR-DGGE、PCR-SSCP、RLFP分析等）；现代生物技术和传统微生物研究方法往往是配合应用，现代生物技术能研究传统方法无法培养的微生物。现代生物技术除了自身还有这样或那样的缺陷外该类技术的积累也有限[6]，还不能完全代替传统的方法，平板计数法在现实中仍然被广泛地应用。但是我们对这种已习以为常的平板计数方法的细节并不是完全地了解，导致做了大量的工作却没有得到与之相应的收益。

平板计数法有涂布法和稀释法两种，稀释法又有稀释法与最大或然数法之分，本文讨论的是平板涂布计数法。

“将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。”。

这个方法也称之生物多样性研究，其实也就只是三大类：细菌、放线菌和真菌，而且这三类微生物也只是比较集中的几种。

平板计数是一种仿生态的方法，但是两者必竟不是相同的系统，而且在这一模仿过程中有太多的细节，微生物的构成种类多而且数量变化不定，影响微生物生长的因素又太多，在实验过程没有掌握好这种复杂性会对计数过程产生很大的影响，也会使得对数据的处理方法产生一些不合适的想法。

1.2平板计数法是一个复杂系统工作

1.2.1过程细节多

测微生物多样性的平板分析法是一个复杂系统问题，其过程细节较多：采样，称样，测量水份，制作培养平板稀释，振荡，吸取取样液，涂布，培养，计数。其中能影响计数结果的细节是：采样时间、地点是否适宜，称样误差，振荡是否充分，取样量是否均一，涂布器的影响，培养的温度和时间是否恰当，计数环节的处理是否恰当。就此方法而言，前几点还是比较容易控制的，但偏偏看起来比较容易的计数环节才是最容易出问题的。

1.2.2影响微生物生长的因素或情况较多

⑴ 微生物的生长存在种内与种间的拮抗、竞争等关系，这会影响平板上的菌落生长情况。

⑵ 菌体的重新生长或芽孢的发生可能存在即时或延缓，先生长或先发芽的菌落或对后生长或发芽的菌体生长或发芽存在影响。

⑶ 细菌平板经培养后PH有四种情况：不变，8.5，9及以上，PH降低（这种情况极少。）。

⑷ 放线菌的平板上会生长很多的芽孢杆菌和其它细菌，PH存在降低的问题，少有不降低的，且一个平板中的PH可能会不同（6.5，5及以下），往往伴随着臭鸡蛋气味。放线菌的重复平板之间的菌落数量往往相差很大。

⑸土壤水分含量及结构、营养等的差异对微生物的种类及生长都有很大的影响。水分会影响好气性微生物的生长，土壤含水量高时，细菌平板的气味多样，除了氨气味、枯草味外还有尸胺味、苹果香味（淡）、尿味等。

⑹气温对微生物的生长也有很大的影响，冬季的微生物数量明显少于夏季的。平板培养在28℃时三种菌群都能生长，26℃以下时放线菌则很少在平板上生长。

1.2.3重复平板上的培养物会出现不一致的情况。

重复平板上的培养物出现不一致的情况在细菌和放线菌的平板上较常见，在放线菌平板上还出现同一皿中的PH值不均一的情况。

1.2.4平板计数方法设计的一些缺陷

⑴ 涂布器对结果的影响

涂布器会沾去一些微生物，这对数量较少的计数结果有相当大的影响。虽然稀释法可以避免这一点，但是处理大量样品时涂布法较混合稀释法方便很多。

⑵ 从采样到测样有时间间隔

从采样到测样存在时间间隔，在这段时间里一般会将土样放在冰箱里保存（不超过两天。），但这就已使微生物的生长状态能够发生变化，在冰箱里放的时间较长一些的细菌平板上容易出现小的菌落密集的区域，也有很少的情况是冰箱里保存了两天之内却在平板上还是有菌落密集区。

⑶ 放线菌与真菌培养结果与土壤中的含量并不相对应

放线菌与真菌的菌丝片断都可以无性繁殖，这使得真菌与放线菌培养结果与土壤中的含量并不相对应。

⑷ 微量体积的稀释液中的真菌、放线菌菌落数量分布不均一的问题

微量体积（一滴0.05ml）的稀释液中的微生物数量分布不均一的现象在真菌培养平板上比较明显，小于10个/皿时重复之间取较大的数。

⑸ 土壤颗粒的吸附细菌对稀释液均一性的影响

土壤颗粒吸附细菌的情况在牛肉膏平板中常有出现，在平板上会形成大的、密集的菌落群，对于这种情况一般可不做计数（其它区域菌落比较清楚的话。），必须计数的话只计边缘显著的菌落。

⑹ 重复平板上的菌落种类有时会有不同

重复平板上的菌落种类有时会有不同，细菌的重复平板上的菌落生长状况基本相同的情况较少，大多数是不同的。重复平板上菌落相同的会在数量上居绝对多数，不同的种类在数量上则较少。

⑺ 放线菌在平板上分布不均匀的问题

放线菌平板培养菌落分布不均匀的问题较细菌严重，有时重复平板之间的菌落数量相差很大。高氏1号培养基经培养土壤放线菌后的平板上生长的其它细菌比较复杂而使平板的微环境出现复杂的变化。

⑻ 平板上菌落数量较少时误差会较大

平板上菌落数量较少时会导致较大的误差，但数量多了真菌菌落不易数。一般地重复的真菌平板的菌落有两、三个差别，四、五也常见，个别的会相差十个以上，由于真菌数量较少而这个差别便是很大的了。相差10个以上就须仔细观察真菌菌种种类以判断是否被污染了，为了慎重，应参考土壤的情况后进行选择。

真菌在土壤中含量个体较少，十倍稀释度下往往也有不能检出的，但不能认为这个稀释度中就没有真菌存在，也有可能是被涂布器沾掉了。

放线菌在平板上不被检出时也不能认为土壤中就没有放线菌或很少，有可能是假现象。

⑼ 平板与土壤并不是完全相同的生态

做微生物多样性的平板培养基虽然采用了基础培养基，但相对于土壤还是一种选择培养基，这会使平板上的菌落数量和种类都要较土壤中的要少。

⑽ 稀释液中的菌体有可能不完全初分离出来

虽然稀释液做了较长时间的振荡但还是有相当的菌体可能并不分离，这使得所得数据会偏低。

⑾ 细菌菌落的形态各种各样，有时相互交差地生长在一起难以分辨清楚，这会导致计数误差比较大。

⑿ 一种菌在平板上可以有不同的形态

枯昔芽孢杆菌在缺乏营养的琼脂平板上可以形成雪花状的菌落，但在牛肉膏蛋白胨平板也成形成这样形状的菌落。

1.3可能的人为因素导致的误差或问题

1.3.1采样

采样的工作安排是有规则的，不了解规便容易出现问题。

⑴土壤的异质性

土壤在垂直方向上是异质的，结构、物质组分、气体都可能不同，自然土壤与耕作土壤又有不同，在调查时须根据这些情况来确定需要调查的位点以保证再次取样的一致性和数据的可研究性。土壤垂直异质性容易被忽视，耕作土壤有比较确定的土层厚度是比较容易做选择的，但自然土壤比较复杂而需要根据其特点在实地加以选择。

在环境条件基本相同的条件下，测量结果不会有突兀的数据。如有，则可能是采样或测样出了问题。

⑵采样的幅度

采样一般要求是五点法，但为什么要采用五点法？一定是要五点法吗？

土壤微生物的样地大小一般主要取决于对这几个因素的要求：气温、湿度、有机质含量、土壤结构、植被种类、C/N比等，其中湿度对微生物菌群的影响是复杂的。样地过大便只能选取一部分代表性土壤作为样地。

抽样的原则是抽取质量指标均一的最小单位。此原则便是调查研究的统计基础，是解决统计学指标代表性问题的关键，也是简化数理方法的关键。

2001年随曹支敏教授对太白山做了一些资源的调查工作，引进了巴西的调查方法：每一百海拔就用五十米分五个点，每个点分四个方向进行采样。当时以之为先进，现在想来这方法肯定是差强人意的，做了太多的工作却难以求真。其实，那次真菌资源调查的方法本来应是部分样地仔细调查。当然，太白山是特殊的，资源调查工作不能十分细致地展开。

采样幅度是根据研究项目要求来安排，并不是固定不变。五点法仅适合质量指标类的调查，样点尽量分布均匀，但不能采在特殊的点上。资源性的调查则是另外的安排。

资源性调查与质量指标调查不同，前者须根尽可能仔细地采样，后者用五点法取代表性。五个样点尽可能均匀分布，不能采在特殊点上。

五个样点的土壤可以混匀只测一次，这样能节省时间和精力。

⑶采样的时间安排

根据气温的变化，一般地以年为周期，每个季节采样一次，调查三年，有些关系到大气变迁的项目需要更长的时间。目前根据早晚气温、雨季、土壤水分、有无风的不同等方面微生态的调查研究还比较少，于是雨季采到样本如何处理便是一个问题。

1.3.2运输、贮藏过程过长

有时采样点较远或是较高时运输过程会较长，这会使测样结果偏高，且计数不容易。

冰箱冷藏一般要求不能超过两天，这两天的时间对大多数的土样测量结果影响不大，但也有个别情况影响是相当大的，会在平板上形成菌落密集区等。这种情况与土壤吸附微生物在菌群状态上是明显不同的，土壤吸附导致的密集区往往较大而更加密集。

1.3.3称量

称量土样过程中产生的误差相对于计数过程产生的误差是可忽略不计，且也没有必要太过精确以致影响称量速度，百分之二、三的误差是可以不必计较的。这一点是重要的，称量工作是比较繁重的，动作有稍微的简化便会大提高称量速率。

1.3.4吸取样液

有经验的操作可以将每次吸液量控制得一致，但是吸样时样液静置的时间或有不同，吸取样液的位置或有不同，这些对结果都会一定的影响（同一样液的对照是相同的，但不同样液或有不同。）。静置时间不足会有土粒及其可能吸附的较多的菌体。

有要求每一个稀释度一支吸管，其实在具体操作中一个样一支吸管是可行的，在对结果的影响可以容忍的范围内减少工作量是重要的。

1.3.5涂布

涂布过程可能造成误差的情况有两种：一是涂布器会沾去相当的样液，在菌落较少时也可能沾去的数量在重复之间或不同。二是，涂布次数过少便涂布不均匀，涂布次数过多又会使土粒吸附的菌体被分散而不易在计数时被排除。

1.3.6计数

计数过程可能产生误差的情况有三种：一、计数过程只能是尽可能地数到，但看不到的情况是存在的。这个不是不认真，在目标数量较多时就是较大的目标也容易出现看了几遍还是看不到的情况是存在的，只是这种情况导致的误差是可以忽略不计的。认识到这一点在实际工作中是重要的，会提高计数的速度。二、对计数规律了解太少会产生较大的计数误差，多数或少数都是可能的，这是平板计数较大误差的主要来源之一。三、二分法估计会存在误差，但这种方法应用得当则其误差可在容许的范围内。

1.3.7数据处理

不了解计数过程中的情况而处理数据会产生很大的误差，不同稀释度之间的平均可能会产生超过100%的误差，远大于计数、采样不当可能造成的误差。数据平均是要讲条件的，两者相差在误差容许的范围内才能平均，相差较大便要做选择，相差较小是难以做出选择的。选择了错误的数据会产生相当大的误差。

1.4土壤气候环境和微环境都复杂而多变

气候的变化会影响到土壤的微环境，主要有气温、风、降雨及水分，其中影响比较显著的是气温和水分。

土壤微环境十分地复杂，除了微生物外还有吃微生物的小动物。不同的化学组成对微生物种类和数量会有影响，其中以有机质的含量多少影响较显著。

土壤水分、C/N对土壤微生物环境的影响巨大以致微生物反过来会影响土壤的性质。

氨化细菌所需最适土壤含水量为田间持水量的50%~75%，最适温度为25~35℃。氨化细胞适宜在中性环境中生长，酸性大的土壤添加石灰可增加氨化细菌的活性。土壤通气状况决定了氨化细菌的优势种群，但通气状况好坏不影响氨化作用的进行。

含氮有机化合物的C/N比对氨化细菌活动强度和氨化过程有较大影响，氨化细菌生长繁殖中要求提供的C/N比为20~25：1。

土壤中氨化作用的强弱除与有机含氮化合物的数量有关外，还受土壤环境条件的影响。在水分适宜、通气良好的中性土壤中,氨化作用能正常进行,作用的速度随温度的升高而加强。另外,土壤中的通气状况不同,参与氨化作用的微生物种类就不同，最终产物也不一样。通气良好时，主要由好气微生物作用，最终产物为氨；在通气不良的条件下，由厌气微生物作用，最终产物为氨和胺。这种不同，通过平板上的菌体种类、PH和气味可以反映出来：牛肉膏培养分离的主要是氨化细菌，经培养后平板上的PH值大多数会升高，一般分离的氨化细菌主要有两个种类，两个平板上的主要菌种不一样的情况较少，种类较多的PH值不变。细菌平板经过培养后PH往往高到8.5甚至大于9.0，培养土壤细菌后的细菌平板一般有枯草味，但，PH值8.5枯草味中加杂氨和胺味，大于9.0时氨味明显单一。

过湿的土壤在细菌平板上会有丝状菌，有些线状的菌落长满整个平板；有污染的土壤中会在放线菌平板上检出蓝色放线菌。好气的放线菌数量也会受到影响。

土壤样品中可培养的微生物占可数微生物的比例只有千分之三，我们对于土壤微生物更多是不了解。而且土壤中的微生物不只是三大类。

2 计数原则、规则及计数方法

平板菌落的生长情况十分复杂，但就计数的要求可分为：菌落清楚的，菌落不清楚的，菌落部分清楚的等。

2.1显数计数原则

显数计数包括两个方面：一是菌落分布均匀而清楚的区域的计数是可靠的；二是生长显著的菌落的计数是可靠的。

有时平板上有些细小得不易看清楚的菌落，数不到不要紧，因为平板计数法适用显数计数原则。有报告要求用放大镜以防遗漏，但从实际操作的重复平板之间的对比来看并不需要这样做（另一平板上往往并无小菌落。），而且小菌落往往是小而多得数不清的（其来源往往也难以清楚。）。但是，有时片状菌落内存在一些菌落是要计数的，这些菌落易被忽视，要小心地反复地观察。

往往有时小心又小心，但还会出现有一些没有计到数，尤其是对放线菌的计数，要在众多的芽孢杆中寻找放线菌而不少计是困难的，有些放线菌是反光看不到的，有些是逆光看不到的，也有视而不见的可能。

显数计数的原则是容许一些计数误差的，因而不必太在意没有计到的菌落。清楚显数计数原则是重要的，这会减少数据处理方面的许多麻烦，使得做出选择比较容易。

显数计数原则是计数技术的核心，平板计数法的所有工作都是围绕着这一原则进行的：称量、振荡、涂布、计数、有效计数范围的确定、数据处理等。

2.2调查计数的一般性原则：

调查对象的情况较复杂，希望一次性就调查到所有的信息是不正确的，这其中存在一个调查计数的一般性原则：第一次调查，只以大多数的情况为主要目标，两极的情况不必精确。

这一原则会大大地简化工作，需要精确两极情况的信息时就不只是需要考虑一般情况的指标了，使其异化的条件会变得很重要。

2.3有效计数范围

平板计数法要求计数范围：细菌（30～300），放线菌（20～200），真菌（10～30）。这是一个认为可以清楚计数的经验规则，但具体的情况要较这个规则复杂得多。

国标SN标准要求的细菌有效计数范围是25～250个菌落/皿，这是不合理的：国标的要求看起来要求更高了，但实际上是不合实际情况的。细菌平板上的菌落数在30个/皿以下时分布不均匀的情况居多，细菌重复平板上的菌落数分布在30个/皿上下的情况很少。将计数范围的最小值下移到25个/皿会大大地增大计数误差，虽然其间只有5个菌落的差别却会导致的误差可能超过50%。细菌平板上350个/皿时仍有分布均匀而清晰可数的，300个/皿的上限已是收窄后要求了。

放线菌的平板菌落情况与细菌不同，放线菌菌落的生长受到的影响较细菌严重，难以获得其数量真值的。20个/皿以下时放线菌落数是否为真很难确认，放线菌菌落数在200～300个/皿时还是很清楚的，确定有效的计数范围（20～200）也是范围收敛了的。

2.4二分法计数规则

二分法有数量二分法与面积二分法，面积二分是根据平板部分的面积上的菌落数量估算整个平板的菌落数量。在平板计数时，面积二分法很是实用。

二分法只是一种意向，在具体应用时也可三分、四分到八分的。三分、五分不如二分、四分、六分那样易于分得精确，有时甚至需要估算到2.5或3.5，这样会产生估计所带来的较大误差，但这样的误差是现实的情况必须产生的，最低的要求也是可以用来作为重复平板之间做出选择时的参照，如此计数结果的重复平板之间相近的情况证明这种方法是恰当的。当每皿超过300个细菌菌落时可用八分法粗略计数，因为这种情况下精确的意义已不大了。放线菌平板的计数甚至要达到十分的。

在平板上的菌落分布不均匀或干扰的情况下并不是如实地数，面积二分法是一种灵活的方法，平板上菌落分布不均一时可依均匀的部分估算。这是遵循显数计数原则而有的一个计数规则。

真菌计数较简单，细菌与放线菌的计数比较复杂：

细菌平板菌落生长的情况比较复杂，有些菌落长得很大而且占了很大的区域（片状过大的不计数。），有很大的丝状菌菌落，也有数不清的线状菌落或链状的菌落（只做一个菌落计。），细菌的菌落形状千奇百样而且有些不易计数，有较大区域的大密度菌落群（这种情况只计外围清楚明显的菌落，稠密区过大要用面积二分法处理。），等等。面积二分法实是一种等面积处理法，相同面积上的菌落数相同，用此法当菌落清楚均匀的部分过小则误差较大。细菌平板上的菌落分布不均匀时有两种情况：一是菌落分布清楚，全数；二是菌落分布不清楚，不同菌落之间干扰较严重，只数相对较密集均匀的区域并估算整个平板上的菌落数。平板上的细菌菌落分布得清楚均匀的部分过小的不能计数。对于大片菌落上生长的菌落要小心地计数，尽量不要漏数。

放线菌重复平板上菌落数存在重复性差的问题，放线菌平板上的菌落分布均匀的情况较少，用面积法估算整个平板的菌落数是必要的。估算方法是依据放线菌平板上的菌落生长清楚均匀的部分估算整个平板的菌落数量，重复平板之间菌落数之间的处理方法是选菌落数较多的计数报告，重复平板上的菌落分布区域太小是不能计数的。

2.5重复平板的处理

2.5.1重复平板的意义

一般地要求做三到五个重复，在实际操作过程只会做到三个重复，因为五个重复的工作量实在太大了，但实际上四个重复就会使得计数工作变得简单。平板计数法的重复平板的意义有两个方面：一是相互印证，二是比较、确认并选择。四、五个重复比三个重复更容易做出选择。

选取代表数的误差应在容许的范围之内，这就要求在三个重复之间的选择需要有一些方法和原则。较少的重复更重要的是要求操作过程的每一步都要标准化以降低操作的偶然因素所导致的较大误差，也就是说，误差仅仅只是操作方面的原因是可以追求没有重复的。

真菌平板上的菌落数有效计数范围是10～30，但实际上：10倍稀释时的真菌菌落数在10个以下和10～30的数量相当，多于30的很少。

在10~30范围内的真菌重复平板上的菌落数相差不大，相差4、5个便是相差比较大的了。极少的情况会相差10个以上的，这时须仔细观察数量多的那个平板是否被污染了，真菌是比较容易被污染的。

重复平中的真菌菌落数少于10个/皿、放线菌少于20个/皿时、细菌少于30个/皿时，以大数字报告之。

细菌和放线菌的重复平板之间在计数范围内则简单地平均是不当的，平均只适用于重复平板的菌落数相近的情况。

细菌菌落数相差率的要求随基数的不同而不同的，数字较大时相差的比率是反而要小一点：细菌菌落数60～150个/每皿时20%，150～300个/每皿以上时15%，数字基数较小（30～60）则要放宽一些（30%）。这种情况并不是普遍的，这只是从一部分重复的计数结果中观察到的结果。在实际的计数数据中，重复数有限而更多的只能作选择。

重复平板上的菌落数相差较大时则要根据平板上的菌落生长情况做取舍，取舍遵循显数计数原则——菌落分布清楚的计数是可靠的。重复平板上的菌落生长也有都不清楚的情况，但都不能计数的情况极少。仔细分析各板的情况，实在不能清楚计数的舍之。重复平板都不能清楚计数的需要重做。

细菌的重复平板之上的细菌种类或有不同，这样重复平板上的数量代表性和菌落数量是不同的，只取一个数字时会掩盖数字代表性的问题，应分别计数报告。一般的细菌平板上的细菌种类只有一两种，细菌种类较多时应注明细菌种类较多。

放线菌的重复平板之间菌落数重复性较差，存在两种情景：一是整个平板上菌落数量分布不均匀，二是局部的菌落数量分布不均匀。因此，在有效计数范围内，重复平板之间取大数字报告之，不做平均。

2.5.2平板培养的重复数及计数方法

A、细菌：做四个重复的细菌平板会大大简化计数工作（容易做出计数选择，稍有犹豫则计数速度就会大大降低。），但是其它工作量较大，一般会选择三个重复。

B、放线菌：放线做四个重复平板会使计数工作变得简单，重要的是计数的精确度会提高，因为放线菌平板上菌落生长情况的变化较多。

C、真菌：真菌平板培养后的PH不会出现变化，做两个重复平板就可以了。

计数工作是一项繁重的工作，简化而有效的方法便重要。重复平板并不需要全部计数，首先选择能够清楚计数的；其次是，超过计数范围上限的只计菌落数较少的一个，其它的都只计较多的一个。因为，在实际操作中重复平板数有限到了能够显数计数而菌落数相近的平板情况出现较少的程度了；重要的是重复平板菌落数的不同是因为受到影响不同所致而成不同的类，自然要选择受影响较小的一个。但是，当有一个平板没有菌落生长或都没有菌落生长时则要计所有的重复，这种不同可能含有某种信息，只是数据处理时：有一个不长菌落时以0.5乘以稀释倍数，都没有菌落时以0.5乘以降格的稀释倍数，并不需将系数按检出菌落的平板占比处理，只是作为一种分类的统一处理，原始的记录可能于以后的继续研究可能有用。重复平板上菌落不同时要分别计数报告。

其实，当菌落数少于10（个/皿）时是可以考虑用平均法的，因为这时的重复之间的不同可能是稀释液微量体积中分布不均匀所致。但是，小于10（个/皿）已是极端的情况，也就不必太过精细了，大致地分一类便可了，故也选数量较多的一个。

2.6稀释度的选择

一般要求是一个土样做三个稀释度，正确的却是做一稀释度合适的稀释度，做三个是在不清楚正确的稀释度下的做法。

“若有二个稀释度均在（30～300）之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。”。国标的这一要求是错误的。落在有效计数范围内的两个稀释度的平板菌落数都不会相同，必有一个是错误的。根据微生物生长的有利条件来判断应选择稀释度较大的一个。至于为什么低稀释度的也会落在有效计数范围，在搅拌、静置、吸取、涂布、计数几个环节都可能出现问题，多数或少数都有可能，但这些情况对于计数者来说是可以根据平板上的菌落情况做出判断的。

浓度较大的平板上的一个单菌落更可能来自样品中的2～3或更多个细胞。

“不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。”。操作一般不会导致如此大的误差，海博生物的平板计数法中提到的是酸性饮料可能出现逆反的情况，海博生物认为不作为检样计数报告的依据是正确的。土壤微生物的平板计数中也有这种情况，极少。一般是低稀释度那个计数容易出现错误导致的，也有可能是高稀释度出现了没有摇匀的情况。

综合以上情况，根据计数的一般性原则，第一次调查工作只计大多数，因此在有经验的情况下只做一个稀释度。

从测样的角度，在测样前获知土壤的PH、肥薄、污染、旱涝等情况会有助于减少因此类问题导致增加的工作量。

根据我们的经验，稀释度的一般选择如下：

A、细菌：冬季10-5，其它季节则是10-6。

B、放线菌与真菌

土壤中的真菌和放线菌平板稀释法一般是：真菌10-1，放线菌10-2倍稀释，这样做就可以确保大多数土壤中的真菌或放线菌的菌落数量落在计数的有效范围内。超出有效计数范围的情况较少。

3.总结：正确认识平板计数的作用并完善此方法

微生物菌群分析是一项复杂系统的工作，本文先是将每一个细节尽可能地做到极致，在此工作的基础上再扩展到复杂系统的思考方面，其实，这两个过程是互训互进的。

系统研究的本质就是在个体、组织、系统之间来回地了解，了解基本情况是重要的。了解的情况愈多，处理信息便愈容易。

统计学的发展是不堪的，但也不是完全的不堪，还是在许多分类方面很是值得称道的，因而继续的思考才能够比较快速地清晰。这一点，在文中体现得很是明显。只所以评价其不堪，是因为统计学太过得势，不得不给其泼点冷水——须是实在地做学问，将数的代表性问题要做得严谨。统计学的致命所在是过度拟合（overfit）而缺乏对细节的细致了解，对专业的链接知识不够重视，因此失却对细节的细致地分类计较的同时也往往会失于整体的把握。建立在统计学基础上的大数据缺乏对链接方面的仔细计较，即缺乏对专业基础科学的深入的研究而不了解信息是否映射原象。建立在统计学基础上的大数据中的啤洒与尿不湿的案例很容易就能看出其假，自然通不过专业的推理或文本溯源，我们的高校正是在这方面的课程设置存在很大的问题：对逻辑学、高数的重视度是不够的，在哲学方面的学习还不如听听音乐、戏曲等领悟到时空的变化会更有用，那个学校的社会科学类的学生做《小学》？在这些方面的比拼应是双一流高校学生素质的分水岭——其表现是——遇到佰生的领域时会找到经得起检验的办法。

Everything is everywhere,the environmert selects.—M.W.Beijerinck.[1-593]这是生态学的一个基本思想，但是，怎样才能了解生态与微生态中已发生的一切呢？

本文虽在平板计数数据求真方面做了很大的努力，但是，复杂系统的信息与系统信息不同，单一信息存在因各种因素的影响而“失真”的噪音问题以及微生态可能已发生变化的问题，多途径获取信息于复杂系统便是很重要的。这一点正是大数据方面应该注意的——复杂系统的信息变化是否具有立地性是需要关注的。

复杂系统的研究要点是对信息的了解要全面，这一点会受到观念、设备等的影响和限制。就平板计数法而言，一般的平板计数忽视了对培养后的平板PH、平板气体的关注。随着微型电子探针的发展，H2、H2S、N2O、H3N、CO2、CH2O等气体及PH值的测量已是比较容易，分辨率达到了0.1PPm甚至 0.01PPm，这种电子探针对于研究土壤微生态是会有帮助的。

对复杂系统中的信息之间的链接关系要了解清楚对于复杂系统研究是很重要的，获取冗余信息也是重要的（不能自信自己已掌握了所有信息，其实问题往往就出在习以为常的地方。）。能够确定无疑的信息是推理的出发点，冗余信息的作用可能并不多余，可能是新发现的起点。

土壤水分含量、温度等的不同会导致土壤中主要微生物种类及生理活动都可能发生变化，这关系到土壤生态与微生态，当前在这方面的研究信息是不够细致的，关于土壤微生态时空变化的信息量不足限制了解土壤生态与微生态的具体情况的途径，进而限制了微生态学在土壤利用与改造等方面的应用。

平板计数法在时间平行方面可以有微生态的保守，在时间轴上会存在随气候变化而有微生态的变化，但是，关于土壤微生态的时空变化方面的研究是不足的，缺乏关于土壤水分变化、白天与晚上等方面更细致的微生态方面的研究。

关于土壤生态与微生态的研究需要更为广博的基础知识，有些领域甚至需要自己开拓，这是土壤复杂性的要求，也是研究土壤学的魅力。当前关于土壤生态与微生态的研究已了有相当的基础积累和设备条件，但中间也加杂了许多的错误，如接种外生菌根真菌可提高树木生长速度50～500倍是否可信？写此文的人是否认识外生态菌根便是一个问题，接种外生菌根真菌是否会形成外生菌根是关键，因为外生菌根的形成有较为严刻的条件——低温与水浸且腐殖层丰富。太白山北坡海拔3300米的高山杜鹃林并不形成外生菌根，土壤较南坡的南天门的冰冷，但树叶只是树叶却不是腐殖层。至于真菌与外生菌根之间的关系也多是意测而不可靠，通过菌索追溯并不可行，菌索长达半米以后变细而受其它菌丝干扰便使得无法追索到底，在野外从外生菌根也并不能容易地观察到外延菌丝。从菌索在腐烂度较高的腐殖质中间变得宽大的形态来判断，所谓的外生真菌是腐生于腐殖质的，与外生菌根之间的关系及探究方法应是被人拟合了。太白山南坡亚高山海拔3000米左右的南天门水浸的巴山冷杉根部全部变成菌根，且菌根数量较正常的根增多而变成繁多密集的丛枝，一旦土壤变得较为干燥则菌根死亡而出现稀疏的正常根。北坡桦树林偶有外生菌根也是形成在水浸、冰冷的较厚的腐殖质层小坑中，北坡腐殖质层中的菌丝没有南天门的多。北坡形成外生菌根的土壤海拔虽然较南天门低，但在9月初时水浸的腐殖质层较南天门的温度冰冷刺骨，手可以感到明显的差异。[ 3]

获取正确的信息与正确处理信息都很重要，这是一个不断提高的过程。平板计数法只简单地计菌数与土壤微生态的复杂性并不适合，本身也存在数据失真的问题。但是平板计数法还是可以获取相当多的土壤微生物及生态及微生态的信息，从复杂系统信息多样性的角度来完善平板计数法会使这一方法具有真正的科学价值，也会使土壤生态与微生态的研究得到发展和完善。当前，已有越来越多的人结合土壤微生物呼吸强度、土壤微生物量等进行土壤微生物多样性的研究，因此，了解清楚平板计数法的每一个细节还是有相当的现实意义。对于平板培养后的PH变化及释放的气体、平板状态差异等与土壤微生态信息的映射关系需要更多的积累，不能停留在只是计数这一点上。

现在已出现了许多能够自动进行菌落计数的仪器，但要做到科学地计数还须依据本文提供的方法和细节更加智能化，灵活地利用面积二分法于估值计数较人工会容易得多，但不是所有的细菌平板上的菌落都可以用计数器计数（这种情况很少。）。

数据求真

我们做土壤菌群分析工作时发现，实际的情况与传统的安排不一样，传统的研究方法安排使得具体工作糊里糊涂。

传统上做三到五个重复，简单地进行平均。没人愿意做到五个重复，工作量太大了。三个重复的工作仍然是非常大的了。

三个重复上的微生物数量和生长情况常常差别很大，这使得计数很难做出选择。应该是，安排这类研究方法的人自己没有计过数。

为了简化工作，我们必须将整个研究过程重新梳理。在这个过程中，我们发现了许多问题。《统计学》需要学习，但只能作为一个研究方法的提示，具体的研究应该如何安排只有在研究的过程中才能知道。

本研究的副产品是提出了新的《土壤酸碱性理论》，物理条件左右了微生物产酸还是产碱从而影响了土壤的酸碱性。并由《土壤酸碱性理论》提出了无缝思维。